Die Firma iX-factory hat in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Carolin Huhn, bis Dezember 2013 am Forschungszentrum Jülich GmbH (Jülich, Deutschland) und nun an der Eberhard Karls Universität Tübingen (Tübingen, Deutschland) tätig, einen mikrofluidischen Glas-Chip als Schnittstelle für die Kopplung von Quarzglaskapillaren für mehrdimensionale elektrophoretische Trennungen unterschiedlicher Analyte entwickelt (Abb. 1). Zur Detektion können verschiedenste Techniken verwendet werden, das Augenmerk liegt jedoch auf der massenspektrometischen Detektion. Mehrdimensionale elektrophoretische Trennungen sind eine der vielversprechendsten analytischen Ansätze für die immer komplexer werdenden Fragestellungen aus bioanalytischen Disziplinen wie z.B. Proteomics und Metabolomics. Der kombinierte Hybrid-Ansatz aus Kapillare und Chip ermöglicht die modulare Kopplung verschiedener elektrophoretischer Trenntechniken, sodass die Instrumentierung an die spezifische analytische Fragestellung probenorientiert angepasst werden kann. Zum Beispiel kann durch die Wahl geeigneter experimenteller Bedingungen die erste elektrophoretische Dimension zur Aufkonzentrierung von Analyten oder zur Entfernung von Probenmatrixbestandteilen verwendet werden. Im Anschluss können dann in der zweiten Dimension die Analyte aufgrund von Unterschieden ihrer physiko-chemischen Eigenschaften, wie ihrer elektrophoretischen Mobilität, ihrem isoelektrischen Punkt, ihrer Säure-Base Eigenschaften oder der Molekülgröße aufgetrennt werden. Diese mikrofluidische mehrdimensionale Plattform ermöglicht die modulare Kombination von hoch orthogonalen elektrophoretischen Trennmethoden und bietet dem Anwender somit ein sehr spezifisches analytisches Werkzeug für komplexe biologische oder industrielle Proben. Zur qualitativen und quantitativen Untersuchung der Analyte können verschiedenste Detektionstechniken, wie die kapazitiv gekoppelte kontaktlose Leitfähigkeitsmessung in der Kapillare oder auf dem Chip, die optische UV-VIS und die massenspektrometische Detektion mit dem zweidimensionalen Aufbau kombiniert werden, was die zuvor angesprochene Modularität unterstreicht. Während der Zusammenarbeit lag der Fokus von iX-factory auf der Ausarbeitung eines angepassten Herstellungsprozesses für den Glas-Chip um den anspruchsvollen Kundenanforderungen gerecht zu werden: Der Chip sollte eine hohe mechanische und thermische Stabilität aufweisen, eine einfache und modulare Fixierung der Kapillaren ermöglichen, Flexibilität hinsichtlich unterschiedlichster Kanalkonfigurationen aufweisen, inert gegenüber verschiedensten Chemikalien sein, sowie die optische UV-VIS und die kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion auf dem Chip selbst erlauben. Der Glas-Chip besteht aus einer Bodenplatte mit geätzten Kanalstrukturen und einer flachen Deckelplatte (200 µm), was die zuvor angesprochene kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion auf dem Chip ermöglicht. Durch die präzise Verbindung beider Chipteile ergeben sich wasserdichte, mikrofluidische Kanäle. Der Verbindungsprozess wurde bei Temperaturen unterhalb von 350°C durchgeführt, um die vorhergenannten Anforderungen zu erfüllen. Damit Flüssigkeiten in die Kanäle des Chips injiziert werden können, wurden dessen Einlässe mit hoher Präzision sandgestrahlt, um die Kapillaren aufzunehmen bzw. zu fixieren. Die Kapillaren mit variablen Längen wurden anschließend mit herkömmlichem Zwei-Komponenten-Epoxid-Kleber final fixiert und versiegelt. Somit werden keine teuren Chiphalter, pneumatische oder hydraulische Komponenten benötigt und der mehrdimensionale Aufbau kann zusammen mit kommerziell erhältlichen Kapillarelektrophorese (CE) Geräten verwendet werden. In Arbeiten der Forschungsgruppe von Prof. Huhn wurde am Forschungszentrum Jülich der mikrofluidische Glas-Chip zunächst in einem einfachen CE Experiment für die elektrophoretische Trennung von drei verschiedenen kationischen Analyten eingesetzt, um die Performance der Chip-Schnittstelle gegen eine intakte Kapillare und ein kommerziell erhältliches PEEK T-Stück zu vergleichen [1]. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in Abb. 2 gezeigt. Die fast vernachlässigbare Bandenverbreiterung der Trennung mit Chip-Schnittstelle und der intakten Kapillare zeigt deutlich die herausragenden Vorteile des Glas-Chips gegenüber dem T-Stück als Schnittstelle aufgrund des geringen Totvolumens und der homogenen Oberflächeneigenschaften in Hinblick auf die Durchführung elektrophoretischer Trennungen sowie seine Robustheit gegenüber der angelegten Hochspannung (± 30 kV). Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Glas-Chips eine zweidimensionale Analyse von menschlichen Angiotensin-Peptiden erfolgreich durchgeführt. Der Aufkonzentrationsschritt der Analyte wurde mittels Leitfähigkeitsdetektion überprüft. Nach anschließender elektrophoretischer Trennung in der zweiten Dimension wurden die Peptide massenspektrometrisch identifiziert [1]. In einer aktuellen Veröffentlichung der Arbeitsgruppe wurde der Aufbau für die gleichzeitige Analyse aller 20 proteinogenen Aminosäuren mit nicht-wässrigen Lösungsmitteln verwendet. Hierbei konnte besonders die chemische Robustheit des mikrofluidischen Glas-Chips nachgewiesen werden [2]. Bei allen Experimenten zeigte der Glas-Chip eine hervorragende Performance in Bezug auf mechanische, elektrische und chemische Stabilität sowie Trennleistung aufgrund des bereits erwähnten geringen Totvolumens und den gleichen Oberflächeneigenschaften zwischen den mikrofluidischen Kanälen und den verwendeten Quarzglas-Kapillaren. In zukünftigen Arbeiten soll die optische UV-VIS Detektion auf dem Glas-Chip mit anschließender massenspektrometrischer Detektion zum Nachweis von Proteinen und anderen biologisch interessanten Analyten implementiert werden.
Literatur:
[1] Kler P. A, Posch T. N, Pattky M, Tiggelaar R. M, Huhn C (2013) J. Chromatogr. A 1297(5): 204-212.
[2] Kler P. A, Huhn C (2014) Anal. Bioanal. Chem. (submitted).
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